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核酸酶污染的过夜鉴定
所有的限制性内切酶与1μg 底物DNA在50μl反应体系中,采用推荐的NEBuffer温育过夜。比较酶切1小时的特征带型和过夜酶切的带型。如果两种情况下带型均明显、没有改变,则说明测试的酶中不存在非特异性的dna酶。可以温育过夜的zui大酶单位数。
核酸外切酶污染鉴定
所有的限制性内切酶与1μg 单双链混合的、3H标记的E.coli DNA在50μl反应体系中,采用随酶提供的NEBuffer,在推荐的温度下温育4小时。通过可溶解的TCA着色,可以计算出反应体系中被标记的DAN的百分比,进而可以显示出核酸外切酶的污染。该种方法可检测出的底线是0.05%。
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限制酶有什么作用?
在DNA重组技术中,限制酶主要用于:
1.在特异位点上切割DNA,产生特异的限制酶片段;
2.建立DNA分子的限制酶图谱;
3.构建基因文库;
4.用限制酶切出的相同的粘性末端,以便重组。
5.许多细菌用切割外来DNA的方法进行自我保护,如切割感1染性噬菌体的DNA.这些细菌产生一种能切割DNA的核酸内切酶,一旦发现外来DNA便将其切割,因此它们有效地限制了噬菌体对细菌的感1染,故这种核酸内切酶被称为限制酶.
6.每种限制酶特异识别专一DNA序列,并在切割位点将其准确切割.
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蓝白斑筛选鉴定
用于克1隆的酶还须通过额外的质量鉴定――蓝白斑筛选鉴定,以确定经酶过量消化后DNA末端的完整性。该种鉴定方法为:用酶10倍过量消化适当的载体上lacZ基因中单一的酶切位点,连接,转化,并涂XGal/IPTG/Amp平板。成功地切割、连接和表达b-galactosidase可以说明克1隆后基因是完整的,内切酶,一个完整的基因产生蓝斑,一个不完整的基因(例如,降解的DNA末端)产生白斑。在进行蓝白斑鉴定中,所有的限制性内切酶产生的白斑数量不应超过3%。
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