选择素elisa试剂盒的实验原理
选择素elisa试剂盒是一类异亲型结合、Ca2 依赖的细胞粘着分子,能与特异糖基识别并结合。主要参与白细胞与血管内皮细胞之间的识别与粘着。
实验原理:
将目标包被于96孔微孔板中,制成固相载体,向微孔中分别加入品或标本,其中的目标连接于固相载体上的结合,然后加入微生物化的目标,将未结合的生物素洗净后,加入HRP标记和亲和素,再次彻底洗涤后加入TMB底物显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下转化成终的。颜色的深浅和样品中的目标呈正相关。用酶1标仪在450nm波长下测定吸光度(O.D.值),计算样品浓度。
精密度:精密度用样品测定值的变异系数CV表示。CV(%)=SD/mean×100
批内差:取同批次选择素elisa试剂盒对低、中、高值定值样本进行定量检测,每份样本连续测定20次,分别计算不同浓度样本的平均值及SD值。
批间差:选取3个不同批次的试剂盒分别对低、中、高值定值样本定量测定,每个样本使用同一试剂盒重复测定8次,分别计算不同浓度样本的平均值及SD值。
批内差: CVlt;10% Inter-批间差: CVlt;13%
经测定,试剂盒在X期内按推荐温度保存,其活性率小于5%。为减小外部因素对试剂盒前后检测值的影响,RNA Markers,实验室的条件需尽量保持一致,尤其是实验室内温度、湿度及温育条件。其次由同一实验员来进行操作可人为误差。
选择素elisa试剂盒识别的配体都是一些寡糖基团,迄今为止发现的配体都是一些具有唾液酸化路易斯寡糖(s-Le,siaglyl-Lewis)或类似结构的分子。一种寡糖基团可以存在多种糖蛋白和糖脂分子上,并分布于多种细胞表面,因此选择素分子配体在体内分布较为广泛。
从动物组织中提取基因组DNA
使用研钵进行匀浆时:
① 取1~100 mg的动物组织或人组织移入冰浴预冷的研钵中,快速用力展研成匀浆。注)下列组织请加液氮研磨至粉末状。
A.富含DNA酶的胰脏、脾1脏、胸腺、淋巴等组织。
B.富含胶原蛋白的皮肤、肌腱等组织。
C.富含角质蛋白的组织或坚硬的组织(如骨骼)等。
② 加入650 μl的Solution A和0.9 μl的RNase A1,温和研磨30秒钟。注)使用上述①-注)的实验材料时,请在加入Solution A及RNase A1后,将研钵置于65℃水浴上研磨1分钟。
③ 收集650 μl研磨好的组织匀浆液移至Collection Tube中。如果匀浆体积不足650 μl,请补充Solution A至650 μl,65℃保温5分钟。
使用研磨棒进行匀浆时:
① 取1~100 mg的动物组织或人组织移入冰浴预冷的Collection Tube 中,用研磨棒快速研磨成糊状。
② 加入350 μl的Solution A和0.9 μl的RNase A1后用研磨棒快速研磨成匀浆。
③ 加入350 μl的Solution A将研磨棒上的匀浆冲入Collection Tube中,充分振荡混合后,65℃保温5分钟。
随着基因组测序、分子生物学检测手段的快速发展,PCR和荧光定量PCR实验,正在越来越多的实验室应用。然而,PCR作为一种高灵敏度的检测手段,PCR的实验结果也容易被各种无关的外源性DNA或RNA所干扰。
PCR实验室中,很容易发生DNA的交叉污染,污染通常来自于离心管、移液器和其他试验设备产生的DNA气溶胶,或DNA溶液污染桌面,或吸样枪不慎将样品或模板核酸吸入枪内。据估算,一个气溶胶颗粒可含48000个DNA拷贝。 因此,为保证PCR试验的数据准确,避免交叉污染,应定期对PCR实验室做DNA污染情况的监测。
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