友名生物 基本PCR

pcr扩增的原理

实验方法原理

①模板DNA的变性：模板DNA经加热至94℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应做准备；

②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；

③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在Taq酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留copy原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复1制链。

重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复1制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟， 2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。

典型的PCR包括高温变性、低温退火、中温延伸三个步骤，通过将这一套过程不断循环，使DNA得以成百万倍的扩增。

PCR循环参数

预变性模板DNA完全变性与PCR酶的完全激1活对PCR能否成功至关重要，建议加热时间参考试剂说明书，一般未修饰的Taq酶激1活时间为两分钟。

变性步骤：循环中一般95℃，30秒足以使各种靶DNA序列完全变性，基本PCR，可能的情况下可缩短该步骤时间。变性时间过长损害酶活性，过短靶序列变性不彻底，易造成扩增失败。

引物退火：退火温度需要从多方面去决定，一般根据引物的Tm值为参考，根据扩增的长度适当下调作为退火温度。然后在此次实验基础上做出预估。退火温度对PCR的特异性有较大影响。

引物延伸：引物延伸一般在72℃进行（Taq酶zui适温度）。但在扩增长度较短且退火温度较高时，本步骤可省略延伸时间随扩增片段长短而定，一般推荐在1000bp以上，含Pfu及其衍生物的衍生设定为1min/kbp。

循环数：大多数PCR含25-35循环，过多易产生非特异扩增。

zui后延伸在zui后一个循环后，反应在72℃维持10-30分钟．使引物延伸完全，并使单链产物退火成双链。

PCR反应特点

灵敏度高：PCR产物的生成量是以指数方式增加的，能将皮克(pg=10-12）量级的起始待测模板扩增到微克（μg=-6）水平。能从100万个细胞中检出一个靶1细胞；在病毒的检测中，PCR的灵敏度可达3个RFU(空斑形成单位）；在细菌学中zui小检出率为3个细菌。

简便、快速：PCR反应用耐高温的Taq DNA聚合酶，一次性地将反应液加好后，即在DNA扩增液和水浴锅上进行变性-退火-延伸反应，一般在2～4 小时完成扩增反应。扩增产物一般用电泳分析，不一定要用同位素，无放1射性污染、易推广。

纯度要求低：不需要分离病毒或细菌及培养细胞，DNA 粗制品及RNA均可作为扩增模板。可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等DNA扩增检测。