pcr扩增的原理
实验方法原理
①模板DNA的变性：模板DNA经加热至94℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应做准备；
②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；
③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在Taq酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留copy原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复1制链。
重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复1制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟， 2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。
典型的PCR包括高温变性、低温退火、中温延伸三个步骤，通过将这一套过程不断循环，使DNA得以成百万倍的扩增。
PCR出现假阴性
不出现扩增条带。PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量及Br乙锭的使用， ④PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。
模板：①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有Taq酶抑制1剂，③模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。⑤模板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，Powerful PCR，其程序亦应 固定不宜随意更改。
PCR引物设计的基本原则
引物长度：15-30bp，常用为20bp左右。
引物碱基：G C含量以40-60%为宜，G C太少扩增效果不佳，G C 过多易出现非特异条带。ATGC建议随机分布，避免5个以上的piao呤或嘧1啶核苷酸的成串排列参照。
引物内部不应出现互补序列。
两个引物之间不应存在互补序列，尤其是避免3 ′端的互补重叠。
引物与非特异扩增区的序列的同源性不要超过70%，
引物3′末端连续8个碱基在待扩增区以外不能有完全互补序列，否则易导致非特异性扩增。引物3‘端的碱基，特别是zui末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，zui佳选择是G和C。
引物的5′端可以修饰。如附加限制酶位点，引入突变位点，用生物素、荧光物质、地1高辛标记，加入其它短序列，包括起始密码子、终止密码子等。
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