出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致,有时其条带更整齐,亮度更高。
引物设计不合适:选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性,因而在进行PCR扩增时,扩增出的PCR产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短,容易出现假阳性。需重新设计引物。
靶序列或扩增产物的交叉污染:这种污染有两种原因:一是整个基因组或大片段的交叉污染,导致假阳性。这种假阳性可用以下方法解决:操作时应小心轻柔,防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。除酶及不能耐高温的物质外,所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。必要时,Taqman探针法定量试剂,在加标本前,反应管和试剂用紫外线照射,以破坏存在的核酸。二是空气中的小片段核酸污染,这些小片段比靶序列短,但有一定的同源性。可互相拼接,与引物互补后,可扩增出PCR产物,而导致假阳性的产生,可用巢式PCR方法来减轻或消除。
PCR技术的基本原理
PCR技术是在模板DNA、引物和四种dNTP等存在的条件下.依赖于DNA聚合酶(T aq酶)的酶.促合成反应。其具体反应分三步:变性、退火、聚合。以上三步为一个循环,每一 循环的产物DNA又可以作为下一个循环模板,数小时后,介于两个引物之间的目的DNA得到了大量的copy,经25~ 30次循环DNA数量可达2x1067拷贝数。
锚定PCR(Anchored PCR. APCR技术. 用酶法在一通用引物反转录cDNA3"-末端加上一段已知序列,然后以此序列为引物结合位点对该cDNA进行扩增,称为APCR.应用:它可用于扩增未知或全知序列,如未知cDNA的制备及低丰度cDNA文库的构建。
LA PCR的原理
LA PCR的关键是具有3′→5′Exonuclease活性 (Proof reading活性) 的耐热性DNA聚合酶。在PCR过程中当有错误的碱基摄入时,反应性能将大幅度下降,TaKaRa Ex Taq 和TaKaRa LA Taq 依靠3′→5′Exonuclease活性可将错配的碱基除去,从而延伸反应能顺利地进行下去,使长链DNA的扩增成为可能。
Taqman探针法定量试剂-友名生物由武汉友名生物技术有限公司提供。武汉友名生物技术有限公司为客户提供“商务服务”等业务,公司拥有“友名生物”等品牌,专注于其它等行业。,在湖北武汉市洪山区野芷湖西路16号创意天地办公04栋701的名声不错。欢迎来电垂询,联系人:董先生。