质粒载体和外源ＤＮＡ中限制酶切位点的性质
如今，质粒载体中限制酶切位点的种类极为繁多，因而通常都有可能找到某种带限制酶切位点恰恰与外源ＤＮＡ部分片段本身毫无二致的载体。这就具备一个不可1比拟的优点，也应是可以用相应的限制酶消化重组质粒崦回收外源ＤＮＡ。另一种方案，则是把片段插入到载体中能产生匹配末端的任何位点中。例如，识别不同的六核苷酸的限制酶BamHl和BglⅡ产生具有相同突出末端的限制酶切片段，这样用BglⅡ消化而制备的外源ＤＮＡ部分片段可以克1隆到用BanHl消化的质粒中。这通常会使接合序列不能被曾用于外源ＤＮＡ或制备载体的任何一种酶所切开。然而很多清况下，用切点位于多克1隆序列侧翼的限制酶进行消化，可将片段从重组质粒中摘出。偶尔在质粒的以及外源ＤＮＡ两端的限制酶切位点之间，不可能找到“门当户对”的搭配关系。这时可用下面两种方案加以解决：
1）在线状质粒末端和（或）外源ＤＮＡ部分片段的末端接上合成在接头或衔接头。
2）在得到控制的反应条件下，用大肠杆1菌ＤＮＡ聚合酶I Ｋlenow片段部分补平带3凹端的ＤＮＡ部分片段。如第九章所讨论，这样常可以使那些不相匹配的限制酶切位点转变为互补末端，从而促进载体和外源ＤＮＡ的连接。因为部分补平的反应消除了同一分子两端彼此配对的能力，故连接反应过程中环化和自身寡聚化的机会也会有所降低
几种酶的比较及限制酶
1几种酶的比较
(1)限制性内切酶:作用于DNA分子，切割磷酸二酯键，形成黏性末端或平末端。
(2) DNA连接酶:作用于DNA分子片段，连接磷酸二酯键，形成重组DNA分子。
(3) DNA聚合酶:作用于脱氧核苷酸，连接磷酸二酯键，形成新的DNA分子。
(4)解旋酶:作用于DNA分子，作用于氢键，形成DNA分子的单链。
2.限制酶:
(1)一种限制酶通常只识别一种特定的碱基序列，快切酶，但是有少数限制酶却可以识别不止
一种碱基序列。
(2)不同限制酶也可以识别同-碱基序列;
(3)不同限制酶识别的碱基序列虽然不同，但切出的末端也可能相互连接。
核酸酶污染的过夜鉴定
所有的限制性内切酶与1μg 底物DNA在50μl反应体系中，采用推荐的NEBuffer温育过夜。比较酶切1小时的特征带型和过夜酶切的带型。如果两种情况下带型均明显、没有改变，则说明测试的酶中不存在非特异性的dna酶。可以温育过夜的zui大酶单位数。
核酸外切酶污染鉴定
所有的限制性内切酶与1μg 单双链混合的、3H标记的E.coli DNA在50μl反应体系中，采用随酶提供的NEBuffer，在推荐的温度下温育4小时。通过可溶解的TCA着色，可以计算出反应体系中被标记的DAN的百分比，进而可以显示出核酸外切酶的污染。该种方法可检测出的底线是0.05%。
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