限制酶全称限制性核酸内切酶。每种限制酶特异识别专一DNA序列，并在切割位点将其准确切割。是基因工程用来切割目的基因的酶，DNA copy不需要。DNA copy需要的是解旋酶和DNA聚合酶。
限制性核酸内切酶是可以识别并附着特定的核苷酸序列，并对每条链中特定部位的两个脱氧核糖核苷酸之间的磷酸二酯键进行切割的一类酶，简称限制酶。根据限制酶的结构，辅因子的需求切位与作用方式，可将限制酶分为三种类型，分别是第yi型（Type I）、第二型（Type II）及第三型（Type III）。Ⅰ型限制性内切酶既能催化宿主DNA的甲Methylation，又催化非Methylation的DNA的水解；而Ⅱ型限制性内切酶只催化非Methylation的DNA的水解。Ⅲ型限制性内切酶同时具有修饰及认知切割的作用。
错位切割含目的基因的DNA部分片段和运载体一形成黏性末端
单酶切：同一种限制酶分别切割含目的基因DNA部分片段与运载体。这是较简单的一种方法，含目的基因的DNA部分片段与运载体在同种限制酶作用下形成相同的黏性末端，这两个黏性末端间能通过碱基间的配对而连接，mRNA切割酶，进而形成重组DNA分子。
用同裂酶去切割含目的基因DNA部分片段与运载体。有一些来源不同的限制酶识别核苷酸顺序和切割位置都相同，这类酶称为同裂酶(同切酶或异源同工酶)。同裂酶产生同样的切割，形成相同的黏性末端。
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