巢式PCR(NEST PCR枝术.
先用一对靶序列的外引物扩增以提高模板量.然后再用一对内引物扩增以得到特异的PCR带。此为巢式PCR。若用一条外引物作内引物则称之为半巢式PCR。为减少 巢式PCR的操作步骤可将外引物设计得比内引物长些，且用量较少。同时在第yi次PCR时采用较高的退火温度而第二次采用较低的退火温度。这样在第yi次PCR时，由于较高退火温度下内引物不能与模板结合，故只有外引物扩增产物，经过若干次循环。待外引物基本消耗尽，无需取出第yi次PCR产物，只需降低退火即可直接进行PCR扩增。这不仅减少操作步骤。同时也降低了交叉污染的机会。这种PCR称中途进退式PCR( drop-in， drop-out PCR)上述三种方法主要用于少量DNA模板的扩增。
LA PCR的原理
LA PCR的关键是具有3′→5′Exonuclease活性 (Proof reading活性) 的耐热性DNA聚合酶。在PCR过程中当有错误的碱基摄入时，反应性能将大幅度下降，TaKaRa Ex Taq 和TaKaRa LA Taq 依靠3′→5′Exonuclease活性可将错配的碱基除去，从而延伸反应能顺利地进行下去，使长链DNA的扩增成为可能。
PCR出现假阴性
不出现扩增条带。PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，多重PCR扩增，②引物的质量与特异性，③酶的质量及Br乙锭的使用， ④PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。
模板：①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有Taq酶抑制1剂，③模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。⑤模板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应 固定不宜随意更改。
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